焦点

新技术能相对精确地切割基因组靶点，适用于对人类细胞进行基因编辑，可也并非完美无缺

基因编辑技术再出新武器

本刊实习生 郭晓/文

最近，河北科技大学副教授韩春雨的一项原创成果成为热点，这项成果对正在风头的基因编辑“明星”技术——CRISPR/Cas9，提出了挑战。

这一新技术立即引起国内外同行的关注，它适用于对人类细胞进行基因编辑。5月2日，顶级刊物《自然生物技术》（Nature Biotechnology）在线发表了韩春雨的论文。

不同于以核糖核酸（RNA）为向导的CRISPR/Cas9技术，新技术来源于格氏嗜盐碱杆菌，这种古细菌的Argonaute（NgAgo）是一种脱氧核糖核酸（DNA）介导的核酸内切酶。

不过，两种技术工作原理一样，即：当经过特别设计的向导DNA或RNA，将核酸内切酶带到靶向基因的特定区域后，核酸内切酶对这一区域进行切割，造成双DNA链断裂，最后，细胞再通过修复机制，对断裂进行修复，实现基因的敲除和插入等。

CRISPR/Cas9技术从2012年开始在研究领域迅速得到了广泛的应用。其局限性在于，一是向导RNA与靶DNA序列之间存在错配；二是Cas9系统需要一个符合一定特征的三碱基序列，这在一定程度上限制了其设计范围。

两年前，荷兰瓦赫宁恩大学的约翰·范德欧斯特研究组证明，嗜热细菌的Argonaute蛋白（TtAgo）可以有效地利用单链DNA作为向导，相对精确地切割基因组靶点。

基因编辑领域的很多同行得知范德欧斯特的这一发现后，非常兴奋，希望能将其发展成一个更简单、实用的基因编辑工具。然而，TtAgo的工作温度在65摄氏度－75摄氏度之间，无法在生理条件下（哺乳动物在37摄氏度左右）发挥功能，这就限制了其在生物体中的应用。

韩春雨在面对这一应用局限时，没有放弃。摆在他面前的有两条路，一是，通过改变该酶的构象，从而使其能在生理条件下工作；二是搜寻Argonaute的同源蛋白，找到能在较低温度发挥功能的同源蛋白。

韩春雨选择了后者。两个月后，韩春雨研究组顺利筛选到NgAgo。

后续的研究证明，与CRISPR/Cas9相比，NgAgo对向导序列—靶序列错配的容忍度很低，具有高特异低脱靶性。此外，基本不存在被其他非向导DNA误导脱靶的可能。

理论上，这一新技术还将基因编辑的精确性提高了1024倍（4的5次方）；并在一定程度上也拓宽了设计范围。

另外一个优点是，实验操作相对更加方便可控。向导单链DNA设计简单，且通过外源转染进细胞，其时间和剂量都可以非常精确地控制。而Cas9系统却难以精确地控制。

韩春雨团队对新成果信心满满，并吸取了CRISPR技术专利权之争的“教训”，在文章被接收的五个月之前（2015年12月）就向国家知识产权局提交了名为“以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术”的发明专利申请。该申请在2016年4月通过审核并公布。

韩春雨团队在专利书中说，“利用本技术，有望实现高特异性和高效率的基因组靶向编辑。”

然而，面对“NgAgo或将取代CRISPR/Cas9技术”这种说法，上海南方模式生物科技发展有限公司技术顾问周效华持保守态度。他对《财经》分析，在过去三四年间，CRISPR/Cas9技术经过科学家不断地完善，已成为基因编辑领域一个重要而稳定的角色。NgAgo这个“新生儿”，则还需要更多的“磨炼”，才能被广泛应用于科研及临床治疗。

毕竟，NgAgo也并非完美无缺。以DNA为向导是NgAgo的优点，同时，也给它在生物医疗的应用带来了阻碍。在基因治疗中，向人体内引入外源DNA是很忌讳的。CRISPR/Cas9系统导入人体后不会在细胞中长期存在，而NgAgo的gDNA导入细胞后可能会被整合到基因组上，带来伦理问题。周效华称，这个障碍可能可以通过降低同源重组过程中插入序列的效率来克服。

此外，周效华认为，目前这个技术在生长分裂旺盛的干细胞中，可能发挥一定效率，而在基因治疗中则应用价值不高。

在未来的临床应用中，NgAgo面临着与CRISPR/Cas9相同的问题：如何提高同源重组的效率。

基因编辑技术在临床上的应用，其中一种类型是通过同源重组，对本身有缺陷的突变进行修复，这一修复过程必然要经过同源重组来替换掉有突变的基因。“目前在CRISPR/Cas9领域已经有研究在克服同源重组效率低的问题，我相信未来研究人员也会关注如何提高NgAgo技术的同源重组效率。”周效华说。